山东淄博地区孕妇脊髓性肌萎缩症筛查及产前诊断分析

魏欣¹,张良忠²,韩佳佳¹,牟凯¹

1.淄博市妇幼保健院,山东 淄博 255000;2. 淄博市周村区妇幼保健院

【摘要】

目的 对山东淄博地区孕妇进行脊髓性肌萎缩症(SMA)携带者筛查,探究该地区SMA携带率情况并分析SMA产前诊断的意义。方法 采用PCR-熔解曲线法技术对孕妇全血样本进行SMN1基因第7和第8外显子(E7、E8)缺失情况进行检测,对结果确定为杂合缺失的孕妇配偶进行SMN1基因检测,为双方都是携带者的孕妇进行产前诊断,采用多重连接探针扩增技术(MLPA)确认胎儿SMN1基因型。另比较淄博市与其他区域SMA携带率差异。结果 在23 750名孕妇中共检出SMA携带者440例,其中E7、E8同时杂合缺失381例,单纯E7杂合缺失59例,携带率为1.85%(440/23 750)。检出夫妻双方同为SMA携带者14对,对高风险胎儿进行产前诊断,检出胎儿SMN1基因E7、E8纯合缺失胎儿2例,SMN1基因E7、E8杂合缺失胎儿4例,SMN1基因E7、E8未缺失胎儿8例。淄博市与甘肃地区、南海地区、新疆地区、佛山地区、江门地区、陕西地区、江苏地区、南充地区、盐城地区SMA携带率差异无统计学意义( P>0.05)。结论 致病基因携带率地区差异无统计学意义,携带者筛查可对高风险胎儿进行筛选,有效预防SMA患儿的出生,对出生缺陷防控及减轻家庭经济及精神负担具有重要意义。

【关键词】 脊髓性肌萎缩症; SMN1基因; 携带者筛查; 产前诊断

中图分类号:R744.8; R746.4 文献标识码:A

文章编号:1671 - 5039(2024)09 - 0868 - 04

脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA) 是由运动神经元存活基因1(motor neuron survival gene 1,SMN1)缺陷导致的一种罕见神经肌肉疾病,该病为常染色体隐性遗传病,发病率为1/10 000~ 1/6 000,携带者频率为 1 / 50 ~ 1 / 40^[1] ,在儿童致死性常染色体遗传疾病中位于第2位^[2],具有发病年龄早,进展快,死亡率高的特点。

据报道,95% 的中国SMA 患者是由携带SMN1 基因第7 外显子纯合缺失导致,其中大部分同时合并第8 外显子的缺失,5% 为SMN1 第7 外显子杂合缺失合并SMN1 基因杂合性点突变或其他变异导致^[3],因此在SMA 携带者筛查中首选检测SMN1 基因E7 缺失情况,但也有文献报道少量SMA 患者仅存在SMN1基因E8纯合缺失^[4],为此本研究对SMN1 基因E7、E8 缺失情况进行检测,完善检测机制。 SMA 患儿的出生给家庭带来巨大的经济和精神压力,但SMA致病基因明确,携带率高,可以通过产前筛查的方式来预防SMA患儿的出生,减轻家庭及社会负担。因此,本研究对淄博地区23 750名孕妇进行SMN1 基因携带情况筛查,明确淄博地区SMA 突变的携带频率,为遗传咨询和产品诊断提供参考依据,并对高风险胎儿进行介入性产前基因诊断,以便有效预防SMA患儿的出生。

1 材料和方法

1.1 一般资料

以2020 年2 月至2023 年2 月在淄博市各级医院产科进行产前检查的孕妇为研究对象,各医院均将SMA 携带者筛查列入本单位孕妇常规产前检查项目,并向孕妇推荐说明,孕妇自愿选择,样本全部集中送至淄博市妇幼保健院进行检测,并对携带者进行遗传咨询。纳入标准:年龄16~47岁, 孕周<22周,均无SMA 表型生育史和家族史。排除标准:有 SMA 生育史及家族史的孕妇。本研究获得医院伦理委员会批准(批准号:202310058),所有纳入研究对象均进行检测前沟通并签署知情同意书。

DOI:10.12183/j.scjpm.2024.0868 基金项目:2023年度淄博市妇幼保健领域科研创新与科技引领计划项目(ZBFY2023013)

作者简介:魏欣(1990—),男,大学本科,主管技师,研究方向:产前筛查与诊断

通信作者:牟凯,E-mail:m18765960192@163.com

1.2 研究内容和方法

1.2.1 携带者筛查流程

依据产前检查孕妇意愿对孕妇进行SMN1基因 E7、E8外显子进行检测,检测结果SMN1基因E7、E8 外显子均为杂合缺失及仅E7外显子为杂合缺失视为携带者,则对其配偶进行SMN1基因检测,若双方都为 携带者,胎儿依据夫妻双方意愿进行胎儿SMA产前诊断,筛查仅限于SMN1基因E7、E8外显子的缺失情况。

1.2.2 样本采集

对接受携带者筛查的孕妇采集外周静脉血2~ 3 mL,收集于EDTA抗凝管;对进行产前诊断的孕妇 抽取羊水10 mL同时采集母体外周血。

1.2.3 DNA提取

孕妇外周血采用西安天隆科技有限公司的全 血提取试剂(SMA-磁珠法)及GeneRotex 96 全自动 核酸提取仪提取DNA,严格按照说明书进行。羊水 用天根生化科技有限公司生产的微量样品基因组 DNA 提取试剂盒提取DNA,DNA 浓度和纯度采用 Thermo NanoDrop 2000紫外分光光度计检测。

1.2.4 基因检测

1.2.4.1 孕妇携带者筛查

采用PCR-熔解法对SMN1 基因E7、E8 外显子 的拷贝数进行定量检测,该方法基于实时荧光定量 PCR,结合了竞争性PCR、饱和荧光染料、熔解曲线分析技术,具有高特异性,高准确性的特点^[5]。实验过程严格按照西安天隆科技有限公司人运动神经 元存活基因1(SMN1)检测试剂盒说明书进行。

1.2.4.1 高风险胎儿产前诊断

在知情同意选择和遗传咨询的基础上,行羊水 穿刺,进行SMN1 产前检测。产前诊断羊水与母体 外周血样本进行QF-PCR 分析短串联重复(short tandem repeat, STR)位点比对,排除母源污染用多 重链接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)方法检测SMN1 基因,另 将样本送至杭州祥音检验所进行验证。

1.3 统计分析

携带率采用SMN1 基因E7 杂合缺失突变数/筛 查总数得出,STR 结果使用GeneMapper 5.0 软件进 行分析,MLPA 结果采用Coffalyser 软件进行分析。 采用SPSS 25.0进行统计学分析,不同区域间携带率 比较采用 χ² 检验,检验水准 α=0.05 ,均为双侧检验。

2 结 果

2.1 筛查结果

在23 750 名孕妇中检出SMN1 基因E7 正常型23 310 人,其中E7、E8 正常型23 233 人,单纯E8 杂 合缺失77 例,检出SMN1 基因E7 杂合缺失突变440 例,其中E7、E8 同时杂合缺失381 例,单纯E7 杂合 缺失59例,携带率为1.85%(440/23 750)。见表1。

表1 淄博地区孕妇SMN1基因E7、E8拷贝数

2.2 产前诊断结果

对上述440例携带者孕妇配偶进行告知并进行 基因检测,同意做基因检测的有405人,发现配偶同 为SMN1基因E7杂合缺失突变者14例,在知情选择 和遗传咨询的基础上对14 例高风险胎儿进行了羊 水穿刺和SMN1基因产前检测,排除母源污染,最终 检出胎儿SMN1 基因E7、E8 纯合缺失胎儿2 例, SMN1 基因E7、E8 杂合缺失胎儿4 例,SMN1 基因 E7、E8未缺失胎儿8例。

2.3 不同区域携带率比较

将淄博市SMA 携带率与甘肃地区、南海地区、 新疆地区、佛山地区、江门地区、陕西地区、江苏地 区、南充地区、盐城地区SMA携带率进行比较,携带 率差异无统计学意义( P>0.05)

表2 淄博地区孕妇SMA携带率与甘肃地区、南海地区、 新疆地区、佛山地区、江门地区、陕西地区、江苏地区、 南充地区、盐城地区SMA携带率比较

3 讨 论

SMA 是一种导致婴幼儿死亡的最常见常染色 隐性遗传疾病之一,人群携带率高,致病基因明确, 通过产前诊断的方式可以有效避免SMA 患儿的出 生,因此具有进行携带者筛查的可行性。目前临床 上有效治疗该病的药物有限,虽一直在做有效药物研究^[15],在中国上市的药物仅有诺西那生钠注射液和利司扑兰,虽然目前都已纳入医保,但大多数家 庭仍然负担不起,并且对于SMA 患儿来说,还需要 多学科的管理以提高生活质量。为减轻疾病带来 的负面影响^[16],因此对孕妇进行SMN1 基因突变筛 查和对高风险胎儿进行产前诊断显得尤其重要。

2008 年,美国医学遗传学和基因组学学会(ACMG) 建议无论种族都应该在普通人群中进行SMA 携带 者筛查^[17]。2017 年,美国妇产科学会(ACOG)建议 对所有孕妇进行SMA 携带者筛查^[18]。2020—2024 年中国相继出台了《脊髓性肌萎缩症遗传学诊断专 家共识》《脊髓性肌萎缩症临床实践指南》《脊髓性 肌萎缩症携带者筛查遗传咨询专家共识》对携带者 筛查人群、筛查流程及筛查前后遗传咨询等方面作 出规范^[19-21],对中国SMA携带者筛查实施具有重要 意义。目前,中国有部分地区已经进行了一定数量的携带者筛查^[6-14,22-23],对预防SMA 患儿出生,降低出生缺陷产生了重要影响。

SMN1 基因的检测方法有多种,实时荧光定量 PCR 技术、PCR-熔解曲线技术,变性高效液相色谱 技术(DHPLC)、多重连接探针扩增技术(MLPA)技 术、二代测序技术等。DHPLC、MLPA、NGS 技术存 在操作繁琐、实验条件和人员要求高、高成本的特 点,因此不适于用于携带者筛查。研究表明^[24],基 于高分辨率熔解曲线实时PCR的方法是一种灵敏、 高通量、低成本、低人工的方法,适用于大规模的 SMA 携带者筛查。但要注意的是该方法学存在一 定的技术局限性,基于目前的技术,只能检查较常 见的“1+0”型携带者,对于少见的“2+0” “1+1d”和 “2+1d”型携带者无法检测出,存在一定的残余风险, 因此在筛查咨询及产前诊断要全面告知残余风险 的存在。

本研究采用PCR-溶解曲线法对淄博地区孕妇 进行SMN1 基因筛查,显示携带率为1.85%。对405 名孕妇携带者的配偶进行基因检测和遗传咨询,丈 夫同为携带者14 例,对14 例高风险胎儿进行了羊 水穿刺和SMN1基因产前检测,排除母源污染,最终 检出胎儿SMN1基因E7、E8纯合缺失胎儿2例,诊断 为SMA患病胎儿,经遗传咨询建议终止妊娠,2对夫 妇均选择引产,避免了SMA 患儿的出生。由于2 对 患病胎儿的父母均来自于沂源县,因此怀疑SMA患 病的地区差异,从而对淄博市与其他区域携带率情 况进行分析与比较,发现携带率差异无统计学意 义,后续研究会对2对夫妇情况进行跟踪,以期明确 相关原因。

综上,本研究通过对淄博地区孕妇样本的筛 查,初步确定淄博地区SMA 突变携带情况,为遗传 咨询和产前诊断提供重要的临床依据,通过筛查筛 选出同为携带者的夫妇,对高风险胎儿进行产前诊 断确定胎儿基因型,做到早诊断、早干预。对脊髓 性肌萎缩症进行携带者筛查有效避免了SMA 患儿 的出生,对降低家庭和社会负担有重要意义。本研 究旨在SMA的二级预防,基于目前的方法学确实有 漏检的可能,即使是当前公认检测技术金标准 MLPA 技术也仅能给出SMN1 与SMN2 的拷贝数信 息,无法对SMN基因的突变情况提供更多有价值的 信息,从遗传系疾病防控的完善性上思考,补充 SMA 三级预防,即新生儿筛查,也尤为重要。目前 《脊髓性肌萎缩症中国三级预防指南》已出台^[25],对 于SMA 新生儿筛查流程与相关问题有了相应规范 与指导,因此在二级预防的基础上进行三级预防有 一定可行性,但也要根据二级预防的覆盖率去全面 考虑这个问题。后续会增加新生儿筛查研究,探讨 SMA 二级预防及三级预防共同对于出生缺陷防控 的意义。

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(收稿日期:2024-02-24)

(本文编辑:江金女,蔡扬)