PCR 结合熔解曲线在高血压药物相关基因突变检测中的应用

PCR 结合熔解曲线在高血压药物相关基因突变检测中的应用

检验医学2022 年7 月第37 卷第7 期 Laboratory Medicine,July 2022,Vol. 37,No. 7

文章编号:1673-8640(2022)07-0646-06
中图分类号:R446.7
文献标志码:A
DOI :10.3969/j.issn.1673-8640.2022.07.010

万长春 ¹, 杨 辉 ², 庄学伟 ³

(1.金湖县人民医院检验科,江苏 金湖 211600;2.中日友好医院检验科,北京 100029; 3.山东省立第三医院检验科,山东 济南 250000)

摘要

目的 评价聚合酶链反应(PCR)结合熔解曲线(简称溶解曲线法)在高血压药物相关基因突变检测中的应用价值。方法 采用PCR熔解曲线法检测100例高血压患者5个高血压药物相关基因的单核苷酸多态性(SNP)位点[细胞色素P450同工酶2D6(CYP2D6)rs1065852、细胞色素P450同工酶2C9(CYP2C9) rs1057910、β1肾上腺素受体(ADRB1)rs1801253、血管紧张素Ⅱ受体1(AGTR1)rs5186、血管紧张素转换酶(ACE)rs1799752],并与DNA测序结果进行比对。对PCR熔解曲线法的准确性、重复性、抗干扰能力进行评价。结果 PCR熔解曲线法与测序法对100例高血压患者的检测结果均一致,符合率为100%;检测5个基因位点Tm值的极值(R)均<0.5℃。血红蛋白(Hb) ≤2 g/L、胆红素(Bil) ≤342 μmol/L、三酰甘油(TG) ≤37 mmol/L对PCR熔解曲线法均无影响,Tm值的变异系数(CV)均≤5%。100例高血压患者中,AGTR1 (c.1166A>C)、CYP2C9*3(c.1075A>C)纯合突变型各1例,CYP2D6*10基因型频率为39.5%,CYP2C9*3 基因型频率为5.5%,ADRB1基因突变型C等位基因频率为62.0%,AGTR1基因突变型C等位基因频率为5.0%, ACE缺失型D等位基的频率为35.0%。结论 PCR熔解曲线法操作简便,对设备要求低,可作为检测降压药物相关基因突变的常规方法。

关键词:聚合酶链反应熔解曲线法;高血压药物相关基因;单核苷酸多态性

Abstract

Objective To assess the clinical application of polymerase chain reaction(PCR) melting curve method in determining hypertensive drug-related gene mutations. Methods Totally,100 hypertension patients were enrolled,and the single nucleotide polymorphism(SNP) sites of hypertensive drug-related gene mutations, including cytochrome P450 2D6(CYP2D6)rs1065852,cytochrome P450 2C9(CYP2C9)rs1057910,betaladrenergic receptor-1(ADRB1)rs1801253,angiotensin Ⅱ receptor 1(AGTR1)rs5186 and angiotensin-converting enzyme(ACE)rs1799752,were determined. DNA sequencing was performed. The accuracy,repeatability,antiinterference and the genotype frequency of PCR melting curve method were evaluated. Results The consistency of PCR melting curve method and DNA sequencing was 100%. The extremum values (R) of the Tm about 5 gene sites were all <0.5℃. Hemoglobin (Hb) ≤2 g/L ,bilirubin (Bil) ≤342 μmol/L, triglyceride (TG) ≤37 mmol/L had no effect on PCR melting curve method. The coefficient of variation (CV) of Tm was ≤5%. In 100 hypertension patients,there was 1 case of AGTR1 (c.1166A>C ) and 1 case of CYP2C9*3(c.1075A>C)homozygous mutations. The genotype frequencies of CYP2D6*10 and CYP2C9*3 were 39.5% and 5.5%,respectively. The genotype frequencies of C allele of mutant ADRB1,C allele of mutant AGTR1 and D allele of ACE deletion were 62.0%,5.0% and 35.0%,respectively. Conclusions PCR melting curve method is simple and has low requirements for equipments,and it can be used as a routine method for determining anti-hypertensive drug-related gene mutations.

Key words:Polymerase chain reaction melting curve method;Hypertensive drug-related gene;Single nucleotide polymorphism

基金项目:山东省自然科学基金资助项目(ZR2020MH321)
作者简介:万长春,男,1972年生,硕士,副主任技师,主要从事感染性疾病及药物基因诊断相关工作
通信作者:庄学伟 ,E-mail:zy708910614@163.com

有统计结果显示,2015年,18周岁及以上人群高血压的知晓率、治疗率和控制率分别为 51.6%、45.8%和16.8% ^[1]。血压的有效控制可降低35%~40%的脑卒中风险、20%~25%的心肌梗死风险、50%以上的心力衰竭风险 ^[2]。在未来20年,预计全球高血压患者将达到15亿 ^[3]。预防和控制高血压,是遏制我国心脑血管疾病发生的核心策略。药物治疗是高血压临床治疗的重要环节,一旦确诊,应在生活方式干预的同时,立即采用药物治疗。高血压患者在接受同一种药物治疗时,其治疗效果、产生的毒副作用及其对药物的耐受性等存在明显差异。遗传多态性是造成不同个体之间药物反应差异的根本原因 ^[4]。细胞色素P450同工酶2D6(cytochrome P450 2D6,CYP2D6)、细胞色素P450同工酶2C9(cytochrome P450 2C9, CYP2C9)、β1肾上腺素受体(betal-adrenergic receptor-1,ADRB1)、血管紧张素Ⅱ受体1 (angiotensin Ⅱ receptor 1,AGTR1)以及血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)是与降压药物相关的基因 ^[5]。本研究拟采用荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)结合熔解曲线(简称PCR熔解曲线法)检测CYP2D6*10 rs1065852、CYP2C9*3 rs1057910、ADRB1 rs1801253、AGTR1 rs5186、 ACE rs1799752位点的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP),并与DNA测序法比较,初步评估PCR熔解曲线法的临床应用价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2018年10—12月中日友好医院就诊的原发性高血压患者100例,其中男61例、女39 例,年龄28~75岁。纳入标准:依据《中国高血压防治指南(2010年修订版)》 ^[6]中原发性高血压的诊断标准,在未使用降压药物的情况下,非同日3次测量血压, 收缩压 ≥18.62 kPa(140 mmHg)和/或舒张压≥11.97 kPa (90 mmHg)。排除标准:严重肝、肾功能损伤者(丙氨酸氨基转移酶或天门冬氨酸氨基转移酶>参考区间上限3倍, 血肌酐 >178 μmol/L、血尿素氮 >9 mmol/L),继发性高血压患者,对 β受体阻滞剂、钙离子拮抗剂、血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂、血管紧张素转化酶抑制剂、利尿剂 这五大类药物有禁忌症者。

1.2 方法

1.2.1 样本采集

采集所有患者静脉血2 mL, 乙二胺四乙酸抗凝,4 ℃保存,24 h内提取基因组DNA。

1.2.2 试剂与仪器

CYP2D6*10( c. 100 C> T)、CYP2C9*3 (c. 1075 A>C)、ADRB1 ( 1165 G>C)、AGTR1 (1166 A>C)、ACE (I/D)检测试剂盒购自无锡锐奇生物科技有限公司。血液基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。干扰物血红蛋白(hemoglobin,Hb)购自生工生物工程(上海)有限公司,胆红素(bilirubin,Bil)及三酰甘油(triglyceride,TG)购自北京索莱宝科技有限公司。Gentier 96E荧光定量PCR仪(西安天隆科技有限公司)。2×Premix Taq测序试剂盒(RR901A)购自宝生物工程(大连)有限公司。ABI 3730自动测序仪(美国ABI公司), nanodrop one紫外分光光度计(美国赛默飞世尔科技有限公司)。

1.2.3 核酸提取

提取人类基因组DNA,采用 nanodrop one紫外分光光度计测定所提取的DNA 浓度和纯度,要求 A_{260 nm}/A_{280 nm} 比值为1.8~2.0 浓度为10~100 ng/μL。

1.2.4 PCR熔解曲线法

严格按试剂盒说明书配制反应体系,5个检测位点分3个反应孔进行, 反应体系混匀后分装至PCR管中,每管18 μL (反应液Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc各8 μL,反应液Ⅱ 5 μL,反应液A 5 μL),然后加入2 μL样本DNA。按试剂盒说明书提供的反应程序进行扩增及熔解曲线分析,5个位点反应条件一致。

1.2.5 测序

采用Primer 5软件设计覆盖 CYP2D6*10 rs1065852、CYP2C9*3 rs1057910、 ADRB1 rs1801253、AGTR1 rs5186、ACE rs1799752共5个SNP位点序列的10条引物。 根据2×Premix Taq测序试剂盒要求建立PCR 反应体系(20 pmol引物、2×Premix Taq 25 μL、模板DNA 200 ng,灭菌水补齐到 50 μL)。测序引物序列:

AGTR1正向引物 5'-TGCACCATGTTTTGAGGTTG-3',反向引 物5'-TTGTTCTTCGAGCAGCCGTCAT-3';

CYP2C9正向引物5'-ACAGGAGCCACATGCCCTAC-3',反向引物5'-GGGACTTCGAAAACATGGAGTT-3';

ACE正向引物5'-AAGCCACTGCTGGAGAGCCACTCCCAT-3',反向引物 5'-TTCCGGGACGTGGCCATCACATTC-3';

CYP2D6正向引物5'-TGCTCCTGGTGGACCTGATG-3',反向引物5'-CTGGTCGAAGCAGTATGGTG-3';

ADRB1正向引物5'-GCCCTCGCGCCTCGTG-3',反向引物5'-GCGGCACGGCTCGTCCA-3'。

1.2.6 结果判读

PCR熔解曲线法结果判读标准:以AGTR1 (1166 A>C)为例,以对照品反应 管为参照,同时出现与对照品相同的2个峰(Tm 值偏差 <1.5℃)的样本为AC杂合子,只出现 1个低Tm值熔解峰的样本为AA纯合子,只出现 1个高Tm值熔解峰的样本为CC纯合子。所有检 测均重复3次。

1.2.7 符合率

以测序法检测结果作为标准, 计算PCR熔解曲线法的符合率。

1.2.8 重复性

随机选取5例样本,平行检测3 次。将2个等位基因熔解峰的Tm值分别记为Tm1 及Tm2,计算5个基因位点Tm值的极值(R)。

1.2.9 抗干扰能力

Hb、Bil、TG为生物组织 样本中最常见的生物源性PCR干扰物质,根据 美国临床实验室标准化协会(the Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)EP7-A文 件中的推荐浓度,将Hb、Bil、TG的粉末状干扰 物分别配制成初始浓度为2 g/L、342 μmol/L、37 mmol/L的原液。对干扰物原液分别进行10倍、100倍、1 000倍稀释。在同一全血样本中 分别加入干扰物原液、10倍稀释液、100倍稀释 液及1 000倍稀释液。采用PCR熔解曲线法检测 CYP2D6*10 rs1065852、CYP2C9*3 rs1057910、 ADRB1 rs1801253、AGTR1 rs5186、ACE rs1799752,重复检测3次。以未加干扰物的样本 作为对照,观察加入不同浓度干扰物后基因型 检测结果的一致性,计算熔解曲线Tm值的变异 系数(coefficient of variation,CV)。

1.3 统计学方法

采用SSPS 19.0软件进行统计分析。呈 正态分布的计量资料以x±s表示,重复性比 较采用Kappa检验。基因型分布采用Hardy-Weinberg平衡检验。以 P<0.05 为差异有统计学 意义。

2 结果

2.1 PCR熔解曲线法与测序法检测结果的符合率

PCR熔解曲线法与测序法对100例高血压患 者的检测结果均一致,符合率为100%。5个基因 的测序结果及熔解曲线见图1。

图1 注:(a)左侧为CYP2D6*10(杂合子CT型)测序图,右侧为熔解曲线图;(b)左侧为ADRB1 (1165G>C) (杂合子GC型)测序图,右侧为熔解曲线图;(c)左侧为AGTR1(1166A>C)(野生纯合子AA型)测序图,右侧为熔解曲线图;(d)左侧为CYP2C9*3 (纯合子AA型)测序图,右侧为熔解曲线图;(e)左侧为ACE(I/D)(插入纯合型)测序图,右侧为熔解曲线图;*表示反向互补序列结果。

2.2 重复性

5个基因位点Tm值的极值(R)均<0.5 ℃。 见表1。

表1 5个基因位点Tm值的重复性(℃)
注:—表示在该位置无熔解曲线峰,即未检出Tm值

2.3 抗干扰能力

Hb ≤2 g/L、 Bil ≤342 μmol/L、 TG ≤37 mmol/L对PCR熔解曲线法无影响(Tm值的 CV 均 ≤5% )。见表2。

表2 PCR熔解曲线法检测5个基因位点的抗干扰能力
注:因干扰物原倍浓度已对检测无影响,所以仅列出原倍浓度的数据;—表示在该处无熔解曲线峰,即未检出 Tm值

2.4 5个基因的基因频率

Hardy-Weinberg平衡检验结果显示, CYP2D6*10、CYP2C9*3、ADRB1 (1165G>C)、AGTR1 (1166 A>C)、ACE(I/D)基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律 (P>0.05),具有群体代表性。

100例高血压患者的5个基因中,AGTR1 (c.1166A>C) 及CYP2C9*3 (c.1075A>C)纯 合突变型各1例,ACE(I/D)、CYP2D6*10 (c.100C>T) 及ADRB1 (c. 1165 G>C) 的突变型 等位基因频率均较高,分别为35.0%、39.5%及 62.0%。各位点的基因型频率与等位基因频率见 表3。

表3 5个基因位点的基因型频率及等位基因频率分布(%)

3 讨论

本研究主要评估了高血压患者对临床常用降压药物的机体代谢情况及药物敏感性, 可用于指导临床选择合适的降压药物,优化药物治疗方案,提升降压效果,尽可能避免 不良反应,实现临床高血压治疗的个性化用药。本研究结果显示,血管紧张素转化酶抑制 剂(angiotensin-converting enzyme inhibitor, ACEI)类药物相关基因 ACE 缺失型D等位基因 频率占35% ,这与李露等 ^[7]统计的亚洲人群ACE 基因D等位基因频率(39.0%)类似。 ACE 基因 DD纯合型个体使用贝那普利和福辛普利钠片 的疗效显著,II纯合型个体使用依那普利和咪 达普利的疗效显著,ID杂合型个体使用ACEI 类药物治疗均有效 ^[4]。AGTR1 A116C多态性及 CYP2C9*3多态性会影响血管紧张素Ⅱ受体阻 滞剂(angiotensin Ⅱ receptor blocker,ARB) 类药物的药效,产生不良反应,CYP2C9*3 突变会导致酶活性降低,携带者服用洛沙坦 后,活性代谢物会减少,药物敏感性降低 ^[8-9], AGTR1 (c.1166A>C) CC基因型会使患者对 ARB类药物的敏感性更高 ^[10]。本研究结果显 示,AGTR1 (c. 1166 A>C ) 的C等位基因频率 为5.0%,CYP2C9*3 (c.1075A>C) 的C等位基 因频率为5.0%,由此推断,大多数高血压患 者对ARB类药物的敏感性及代谢均处于正常水 平。与β受体阻滞剂相关的基因位点CYP2D6*10 (c. 100 C>T )是亚洲人群常见的突变之一,发 生率约为50% ^[11]。本研究结果显示,CYP2D6*10 (c. 100 C>T )突变发生率为39.5%,低于文献报 道 ^[11]的结果,可能与本研究样本量较小有关。 CYP2D6*10 (c. 100 C>T) 突变会导致CYP2D6 代谢β受体阻滞剂的代谢能力显著下降,血药浓 度升高,不良反应风险增加 ^[9]。另1个与β受体阻 滞剂相关的基因位点为ADRB1,其编码的蛋白 是β受体阻滞剂类药物降压作用的靶点,ADRB1 (c. 1165 G>C ) 纯合突变型对β受体阻滞剂的敏 感性更强 ^[12]。

现有的基因突变检测技术在基因筛查中各 有局限性,如以PCR为基础的单链构象多态性分 析易受杂交条件及洗脱条件的影响,因此不适 用于临床常规检测;PCR结合反向点杂交技术 检测突变位点时依靠等位基因特异性探针与目 的DNA的杂交,结果需要人工判定,因其检测 过程中需要开盖转移扩增产物,因此环境极易 受到污染,这也限制了其在大规模筛查中的使用;高分辨熔解曲线每次只能检测1个位点,无 法进行大规模检测;作为检测突变“金标准” 的DNA测序成本较高,且检测时间长,不适用 于基因突变的常规检测。本研究使用的PCR熔解 曲线法的检测结果与DNA测序结果的一致性为 100%,准确性、重复性及抗干扰性较强,方法 简便、灵活,对设备硬件要求较低,适用于普 通PCR实验室,因此可作为高血压药物相关基因 SNP位点的常规检测方法。

综上所述,PCR熔解曲线法操作简便、对设 备要求低,可作为检测高血压药物相关基因突 变的常规方法,有助于临床制定最佳的治疗方 案,并进行用药指导。

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(收稿日期:2021-04-23;修回日期:2022-01-09)
(本文编辑:龚晓霖)