体外诊断试剂技术文章

不同商品化试剂盒定量检测肝癌晚期患者乙型肝炎病毒DNA结果的差异

采用天隆HBV DNA试剂盒及提取仪检测肝癌患者，对比罗氏试剂，天隆可检出因P区缺失造成的阳性样本。

� 赵佳，尚文会，田召兵，高庆娥，田秀俊 · 最后更新 2026/07/22 · 预计阅读时间 17分钟

不同商品化试剂盒定量检测肝癌晚期患者乙型肝炎病毒DNA结果的差异

赵佳¹,尚文会²,田召兵²,高庆娥²,田秀俊²

(1.西安市中心医院检验科,陕西西安 710003;2.淄博市传染病医院检验科,山东淄博 255067)

摘要

目的探讨不同商品化试剂盒定量检测肝癌晚期患者乙型肝炎病毒(HBV)DNA结果的差异。方法选择2013年10月2日淄博市传染病医院收治的1例肝癌患者为研究对象。分别使用罗氏诊断产品(上海)有限公司和天隆科技有限公司的HBV DNA定量检测试剂盒对该例肝癌患者血清样本进行不同时间的4次HBV载量检测。取患者3mL血清进行二代测序,并将肝癌患者基因组中HBV开放阅读框Precore/core区序列与通用参考序列比对,分析差异区域。应用MiSeqRepoter软件对二代测序结果进行分析,寻找患者染色体中嵌合的HBV基因组序列。结果罗氏诊断产品(上海)有限公司HBV DNA定量试剂盒4次检测结果均为HBV感染阴性,天隆科技有限公司HBV DNA定量试剂盒4次检测HBV载量均 >1 ×10⁴ IU·L^-1 均为感染阳性。二代测序结果显示患者基因组中含有病毒DNA读长509617bp(1%),509617bp病毒DNA中498064bp(98%)为HBV DNA。与通用序列比对结果显示,肝癌患者基因组中HBV Precore/core区序列中未发现突变位点,患者基因组中的HBV Precore/core区中P区1700~2140bp区间缺失。二代测序结果显示,患者多条染色体上整合了HBV基因组,其中5号染色体上HBV基因组读长3136bp,1号染色体上HBV基因组读长2274bp,10号染色体上HBV基因组读长51bp,6号染色体上HBV基因组读长47bp。结论不同商品化HBV DNA定量试剂盒检测结果存在差异,可能是HBV感染时整合到宿主染色体上导致的序列缺失,在使用不同的检测试剂盒进行临床诊断时务必慎重。

关键词: 乙型肝炎病毒;DNA定量检测;二代测序;肝癌晚期

中图分类号:R512.6+2;R735.7 文献标志码:A 文章编号:1004⁃7239(2022)12⁃1155⁃03

Difference of quantitative detection of hepatitis B virus DNA in patients with advanced liver cancer by different commercial kits

ZHAO Jia¹,SHANG Wenhui²,TIAN Zhaobing²,GAO Qing′e²,TIAN Xiujun²

(1.Department of Clinical Laboratory,Xi′an Central Hospital,Xi′an 710003,Shaanxi Province,China;2.Department of Clinical Laboratory,Zibo Infectious Disease Hospital,Zibo 255067,Shandong Province,China)

Abstract

Objective To investigate the difference of quantitative detection results of hepatitis B virus(HBV)DNA in patients with advanced liver cancer by different commercial kits. Methods One HCC patient with liver cancer admitted to Zibo Infectious Diseases Hospital on October 2,2013 was selected as the research object. The HBV DNA quantitative detection kits of Roche Diagnostic Products(Shanghai)Co.,Ltd.and Tianlong Technology Co.,Ltd.were used to detect the HBV load of serum samples from the same liver cancer patient for four times at different times. A total of 3mL serum of the patient was collected for second generation sequencing,and the HBV open reading frame Precore/core region sequence in the genome of liver cancer patients was compared with the universal reference sequence to find the difference region. The second generation sequencing result was analyzed by MiSeq Repoter software to find chimeric HBV genome sequences in patients′ chromosomes. Results The results of four tests with Roche Diagnostic Products(Shanghai)Co.,Ltd.HBV DNA quantitative kit were negative for HBV infection;the HBV load of four tests with Tianlong Technology Co.,Ltd.HBV DNA quantitative kit were >1 ×10⁴ IU·L^-1 all were positive for HBV infection. The second generation sequencing results showed that 509617bp(1%)of viral DNA were read in the patient′s genome,and 498064bp(98%)of the 509617bp of viral DNA were HBV DNA. The results of comparison between HBV Precore/core region sequence and general sequence in liver cancer patients′ genome showed that no mutation site was found,and the 1700-2140bp range of P region in HBV Precore/core region in patients′ genome was missing. The analysis of the second generation sequencing results showed that the patient′s HBV genome was integrated on multiple chromosomes,including 3136bp of HBV genome read on chromosome 5,2274bp on chromosome 1,51bp on chromosome 10,and 47bp on chromosome 6. Conclusion The detection results of different commercial HBV DNA quantitative kits are different,which may be due to the sequence deletion caused by the integration of HBV DNA into the host chromosome during HBV infection. It is necessary to be careful when using different detection kits for clinical diagnosis.

Keywords: hepatitis B virus;DNA quantitative detection;second generation sequencing;advanced liver cancer

DOI:10.7683/xxyxyxb.2022.12.010
收稿日期:2021-07-14
基金项目:西安市科技计划项目[编号:201805102YX10SF36(6)];西安市中心医院科研基金(编号:2021YB04)
作者简介:赵佳(1984-),女,陕西西安人,博士,副主任技师,研究方向:感染性疾病的分子检测。
通信作者:田秀俊(1964-),男,山东淄博人,本科,副主任检验技师,研究方向:分子生物学;E⁃mail:2855781520@qq.com

肝癌是世界上第六大流行和第三大致死癌症,每年造成约80万人死亡^[1⁃2]。在引起肝癌的风险因素中,乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染发挥着主要作用,全球超过50%的肝癌患者感染了HBV^[3⁃4]。HBV有多种亚型,在我国以B、C亚型最常见。HBV介导肝癌的发病机制主要为HBV基因组整合到宿主细胞基因组中引起基因组不稳定和插入突变,且HBV基因产物具有致癌活性^[5⁃6]。靶向HBV诱导的肝癌发生机制是非常有前景的治疗策略,可以发现潜在的肝癌预防和治疗的生物标志物和靶点。因此,对于HBV病毒的筛查、诊断和监测具有重要的临床意义^[7]。

目前,除了检测HBV血清学标志物外,基于实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)技术检测HBV DNA已广泛应用于临床^[8]。目前,市场上有多种商品化HBV DNA超敏定量试剂盒已获国家药品监督管理局批准。由于临床上定量检测患者血清中HBV DNA时使用的试剂盒存在差异,且可能导致检测结果的差异。基于此,本研究对同一肝癌患者使用不同商品化试剂盒定量检测血清样本中HBV DNA,并通过全基因组二代测序技术分析导致检测结果差异的潜在原因,以期为HBV感染的临床诊断提供检测方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2013年10月2日淄博市传染病医院收治的1例肝癌患者为研究对象。该例患者经临床诊断为HCC3b期^[4]。2020年9月17日患者的相关临床血清及生物化学检测数据显示,患者乙型肝炎表面抗体HBsAg、HBeAb、HBcAb均呈阳性,且肝功能指标(天门冬氨酸氨基转移酶、甲胎蛋白)也异常升高,提示患者HBV感染阳性,且肝功能受损。本研究获医院医学伦理学委员会审核批准。

1.2 试剂与仪器

HBV DNA定量试剂盒分别购自罗氏诊断产品(上海)有限公司(文中简称为罗氏) 和西安天隆科技有限公司(文中简称为天隆)。核酸提取仪器购自西安天隆科技有限公司,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪购自罗氏诊断产品(上海)有限公司。慧算医疗科技(上海)有限公司Illumina测序平台提供二代测序服务。

1.3 方法

1.3.1 HBV DNA定量检测

2020年8月25日抽取HCC患者静脉血10mL, 3000 r·min^-1离心5min,取上清。分别使用罗氏和天隆公司的HBV DNA定量试剂盒于2020年8月27日、2020年9月10日、2020年9月17日、2020年11月19日对肝癌患者血清样本进行4次HBV载量检测,具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行,HBV 载量 <1 ×10⁴ IU·L^-1 表示感染阴性。

1.3.2 二代测序

取患者3mL血清,由慧算医疗科技(上海)有限公司进行二代测序。以文献^[9]中的HBV亚型(9种B型及15种C型)为参考建立一条通用参考序列。取肝癌患者基因组中HBV开放阅读框Precore/core区序列与通用参考序列比对,寻找差异区域。如二者序列比对后完全一致,则无突变;如二者序列比对发现有位点碱基不一致,则发生突变。应用MiSeqRepoter软件对二代测序结果进行分析,寻找患者染色体中嵌合的HBV基因组序列,并定位到具体染色体上。

2 结果

2.1 2种HBV DNA定量试剂盒检测患者血清中HBV载量比较结果

罗氏定量试剂盒4次检测结果均为HBV感染阴性,天隆HBV DNA定量试剂盒4次检测HBV载量均 >1 ×10⁴ IU·L^-1 ,均为HBV感染。

表1 2种HBV DNA定量试剂盒检测肝癌患者血清中 HBV载量比较

注:“ -”表示未检出。

2.2 二代测序结果

二代测序结果显示,患者基因组中含有人DNA读长36417246bp(99%)、病毒DNA读长509617bp(1%)。509617bp病毒DNA中498064bp(98%)为HBV DNA。与通用序列比对结果显示,HCC患者基因组中HBV Precore/core区序列中未发现突变位点,患者基因组中HBV Precore/core区中P区1700~2140bp区间缺失。

二代测序结果分析显示,患者多条染色体上整合了HBV基因组,其中5号染色体上HBV基因组读长3136bp,1号染色体上HBV基因组读长2274bp,10号染色体上HBV基因组读长51bp,6号染色体上HBV基因组读长47bp。

图1 肝癌患者基因组中HBV DNA序列与通用序列比对结果
绿线:HBV基因组开放阅读框;灰线:通用序列;深蓝色曲线:正向测序每个区域读长数;浅蓝色曲线:反向测序每个区域的读长数。

3 讨论

二代测序技术突破了Sanger测序的局限,对于样本中的每对碱基可以达到10000次以上的覆盖^[9]。因此,在病毒相关研究方面极大地提高了检测低频率变异位点的敏感度。此外,随着计算机技术和统计学方法的发展,研究者能够更精准地了解病毒的组成结构和多样性。基于此,本研究从肝癌患者血清提取DNA进行二代测序以探究导致不同商品化试剂盒定量检测HBV结果差异的原因。

本研究结果显示,罗氏HBV DNA定量试剂盒4次检测结果均为HBV感染阴性,天隆HBV DNA定量试剂盒4次检测结果均为HBV感染阳性,检测结果存在较大差异,故对患者血清进行二代测序以探究差异潜在的原因。本研究将肝癌患者基因组中HBV Precore/core区序列与通用序列比对结果显示,并未发现突变位点;患者基因组中HBV Precore/core区中P区1700~2140bp区间缺失,进一步分析发现该区域正是罗氏试剂盒检测的靶标位点,因此,导致罗氏试剂盒无法检测到HBV感染。

有研究发现,HBV DNA整合主要发生在病毒感染早期,为随机整合,但有相对热点的染色体,且整合发生频率很高,在HBV感染相关的肝癌患者中,85%~90%患者染色体发生了HBV DNA整合^[10]。有研究表明,HBV可以通过DNA整合来影响整合位点周围基因功能,破坏或促进细胞生长、分化相关基因的表达,从而促进肝细胞恶性转化^[11]。本研究对HBV DNA基因整合到人染色体的嵌合位点进行分析,结果发现,患者多条染色体上整合了HBV基因组,其中5号染色体上HBV基因组读长3136bp,1号染色体上读长2274bp,10号染色体上读长51bp,6号染色体上读长47bp。

此外,本研究二代测序结果显示,患者基因组中含有病毒DNA读长509617bp(1%),509617bp病毒DNA中498064bp(98%)为HBV DNA。这说明,本研究纳入的肝癌患者染色体上整合了HBV基因,推测HBV感染时基因组整合到宿主染色体上可能是患者血清中的HBV基因组P区序列缺失的原因,但仍有待进一步阐明。另外,对于测序结果中检出病毒,并不等同于存在活性HBV病毒颗粒,还需要对测序结果进行更加深入细致的分析。

综上所述,不同商品化HBV DNA定量试剂盒检测结果存在差异,根源为HBV基因组整合至宿主染色体引发靶序列缺失,临床使用不同试剂盒开展HBV诊断时必须谨慎判读结果。

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(本文编辑:郭潇)