建立一种高灵敏的HBV核酸定量检测方法

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•论 著•

建立一种高灵敏的HBV 核酸定量检测方法

李卓 ¹ 于海涛 ² 高娟 ¹ 黄燕 ³★

[摘 要]

目的 建立一种高灵敏度的TaqMan 实时荧光PCR 法用于HBV 核酸定量检测,并评估其临床性能｡方法 针对HBV 保守序列设计引物探针,收集来自国内3 家医院共计631 例样本,利用本文建立的方法进行HBV 核酸定量检测,评估其灵敏度､特异性和重复性,并与普遍采用的对照试剂盒进行比较,评价该方法的临床性能｡结果 本文建立的HBV 核酸定量检测方法对5 IU/mL 的HBV 血清和血浆样本的检出率均为100 %,且对HBV 强阳性､弱阳性和临界阳性样本的阳性检出率均为100%;该方法对于可能存在交叉的15 种病原体､内源干扰物及外源干扰物均无交叉反应;与对照试剂的检测结果比较基本相同,对于不一致的样本,经过复检均和本文建立的检测方法结果一致｡结论 该方法具有较高的灵敏度,稳定性和重复性好,特异性强,具有较高的临床应用价值｡

[关键词]HBV;高灵敏核酸定量检测;TaqMan 实时荧光PCR

DOI:10.19930/j.cnki.jmdt.2022.09.044

Establishment of a highly sensitive quantitative detection method for HBV nucleic acid

(1. Department of Laboratory Medicine,the First Affiliated Hospital of Xi’an Medical University,Xi’an, Shaanxi,China,710077;2. Department of Laboratory Medicine,Sir Run Run Shaw Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou,Zhejiang,China,310020;3. Department of Infectious Diseases, Xiangya Hospital of Central South University,Changsha,Hunan,China,410008)

[ABSTRACT]

Objective To establish a highly sensitive TaqMan real ⁃ time PCR method for HBV DNA quantitative detection and evaluate the clinical performance of this method. Methods The primers and probes were designed based on HBV conservative sequence. A total of 631 samples were collected from three hospitals in China. The nucleic acid of HBV was quantified using the method we established. The sensitivity, specificity and reproducibility of the method were compared with the commonly used HBV detection kit,and the clinical performance of this method was evaluated. Results The HBV nucleic acid quantitative detection method established in this paper has a detection rate of 100% for 5 IU/mL HBV serum and plasma samples. The positive detection rates of strong positive samples,weak positive samples and critical positive samples were all 100%. This method has no cross⁃reaction to 15 pathogens,endogenous and exogenous distractors. Compared with the control reagent,the qualitative results were similar. For the inconsistent samples,the re⁃test results were consistent with the test method established in this study. Conclusion This method has high sensitivity, good stability and repeatability,strong specificity,and has high clinical application value.

[KEY WORDS]HBV;Highly sensitive quantitative nucleic acid detection;TaqMan real⁃time fluorescence PCR

基金项目:国家科技重大专项(2018ZX10732⁃202);国家自然科学基金项目(82102471)

作者单位:1. 西安医学院第一附属医院检验科,陕西,西安710077 2. 浙江大学医学院附属邵逸夫医院检验科,浙江,杭州310020 3. 中南大学湘雅医院感染病科,湖南,长沙410008

★通信作者:黄燕,E⁃mail:drhyan@163.com

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全球范围内约有2.5 亿人感染慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV) [1]｡感染HBV 后,约有15~40%会进展为肝硬化､肝衰竭甚至肝癌 [1⁃2],每年导致近100 万人死亡｡我国人群HBV 携带率约为 10%,有超过1 亿的无症状病毒携带者以及2 000 多万慢性乙肝患者 [3],给社会经济和医疗带来巨大负担｡

准确诊断联合预防策略,对于指导患者管理以及控制HBV 向易感人群的传播尤为重要,HBV 核酸定量检测是评价疗效和预后最常用的方法 [4⁃6]｡目前,国内已有很多商品化的HBV 核酸检测试剂盒,但由于不同试剂盒往往针对病毒核酸不同位点,检测性能差别较大,灵敏度和特异性难以满足临床需求 [7]｡本研究拟建立一种灵敏度高､特异性强､操作简便､更适用于临床的HBV 核酸定量检测方法,全面评估该方法的灵敏度､特异性和重复性,同时与另外一种普遍使用的HBV 核酸检测试剂盒进行比较,从而评价该方法的临床性能｡

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2020 年2 月至2021 年6 月来自中南大学湘雅医院､浙江大学医学院附属邵逸夫医院和西安医学院第一附属医院,共计631 例样本,包括血浆60 例,血清571 例(其中60 例与血浆样本为同一来源)｡所有参与单位均通过医学伦理部门审核同意｡

1.2 仪器与试剂

采用西安天隆科技有限公司生产的全自动核酸提取仪及其配套的核酸提取或纯化试剂盒(批号: PANA9600S)进行核酸提取;采用A 公司生产的 “乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒(PCR⁃荧光探针法)” (批号:2019008)作为对照试剂;B 公司生产的“乙型肝炎病毒(HBV)核酸检测试剂盒(PCR⁃荧光探针法)” (批号:C0010481902)作为复核试剂;qPCR 预混液､Taq DNA 聚合酶及UNG 酶,均来自西安天隆科技有限公司(批号:P1662001001);实时荧光定量PCR 仪购自美国ABI公司(Thermo Fisher,AB1 7500)｡

1.3 方法

1.3.1 核酸提取及浓度测定

所有采集的血清和血浆样本,采用全自动核酸提取仪及其配套试剂盒进行DNA 提取,并用紫外分光光度计检测DNA 浓度和质量｡

1.3.2 HBV 核酸定量检测方法

①引物及探针的设计:选用HBV 病毒保守基因片段设计引物及特异TaqMan 探针,并利用 Primer Express 软件设计一段人工合成的非竞争性序列为内标模板,设计引物探针,内标探针选用 VIC 通道荧光标记;②TaqMan 实时荧光PCR 进行 HBV 核酸定量检测:配制PCR 反应液,包括qPCR 预混液,4.2 μL 引物探针混合液,0.4 μL Taq DNA 聚合酶,0.4 μL UNG 酶｡向反应液中分别加入20 μL HBV 质控品或定量标准品,以及样品DNA｡ PCR 扩增程序为:50℃2 min,95℃3 min,随后 94℃15 s,55℃15 s,最后72℃15 s,共5 个循环; 随后94℃15 s,60℃30 s,共40 个循环｡目标基因 FAM 通道的 Ct 值 <35 ,内标VIC 通道的 Ct 值 <40 , 则判断该样本为HBV 阳性,否则为阴性｡HBV 强阳性质控品Ct 值应小于20,HBV 临界阳性质控品 Ct 值应在25~30 之间,HBV 阴性质控品Ct 值无数据且内标Ct 值<40｡

1.3.3 灵敏度分析

采用灭活的人源HBV 阴性血清和血浆样本, 将HBV 核酸国家标准品(300022⁃201601)血清及血浆样本稀释,制备K1(20 IU/mL)､K2(15 IU/mL)､ K3(10 IU/mL)､K4(5 IU/ mL)､K5(2.5 IU/ mL) 样本,对样品中的HBV 进行定量检测,每份样本 重复检测24 次,分三天进行｡计算检出率和Ct 值 的变异系数(CV,%)｡

1.3.4 重复性分析

采用灭活的人HBV 阴性血浆样本,将商品化的HBV 血浆(包含HBV A~H 型别)按型别分别稀释,制备成强阳性样本(5 log IU/mL)､弱阳性样本(2 log IU/mL)､临界阳性样本(1.3 log IU/mL)｡所有样本在不同时间重复检测,每个样本共重复20 次,计算检出率及Ct 值的变异系数(CV,%)｡

1.3.5 特异性分析

采用干扰物添加方法进行特异性分析｡①收集可能与HBV 存在交叉的15 种临床样本,包括丙型肝炎病毒､戊型肝炎病毒､人类疱疹病毒Ⅳ型､ 人巨细胞病毒､甲型肝炎病毒､单纯疱疹病毒 Ⅰ型､单纯疱疹病毒Ⅱ型､结核分枝杆菌､白色念珠菌､金黄色葡萄球菌､人类免疫缺陷病毒､梅毒､ 甲型流感病毒､痤疮丙酸杆菌和人类疱疹病毒Ⅵ型 等样本,经确认为HBV 阴性｡细菌感染的水平为 10⁶ 或更高,病毒为 10⁵ pfu / mL 或更高｡所有样本重复检测3 次;②内源性干扰:采用正常血清和含有30 mg/mL 游离血红蛋白､60 mg/mL 甘油三酯､0.6 mg/mL 胆红素､40 mg/mLIgG 及80 IU/mL 类风湿因子的血清样品,分别制备HBV 终浓度为 30 IU/mL 的血清,重复检测5 次;③外源性干扰:针对HBV 常用治疗药物,采用正常的血浆和含有 300 U/mL 干扰素α,4.5 μg/mL 拉米夫定,75 ng/mL 阿德福韦酯,15 μg/mL 替比夫定,50 ng/mL 恩替卡韦的血浆,制备至终浓度30 IU/mL,重复3 次｡

1.3.6 乙型肝炎病毒核酸定量检测的对照分析及结果复核

对照试剂采用A 公司生产的HBV 核酸测定试剂盒(检测下限为500 copies/mL),所有血清和 血浆样本采用本文提出的HBV 核酸定量检测方 法和对照试剂盒同时进行检测,结果不一致的样 本采用B 公司生产的HBV 核酸检测试剂盒(检测 下限为5 IU/mL)进行复核检测｡

1.3.7 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析;计量 资料用( $\bar{x} \pm s$ )表示,计数资料以(%)表示;采用 Passing⁃Bablok 回归分析进行一致性评价和Kappa 统计分析,评估HBV 核酸定量检测方法的临床性 能;以 P<0.05 为差异有统计学意义｡

2 结果

2.1 HBV 核酸定量检测方法的灵敏度及重复性 评估

HBV 核酸定量检测方法对标准品中5 IU/mL 的血清(图1A)和血浆样本(图1B)的检出率均为 100%,检测 CV ≤5 % ,且与理论值浓度偏差0.5,重 复性检测结果,强阳性样本､弱阳性样本和临界阳 性样本的阳性检出率均为100%,且所有样本的Ct 值的 CV 值均 ≤5 % 。见表1。

表1 HBV 分型检测结果 Table 1 Results of the HBV subtyping test

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2.2 HBV 核酸定量检测方法的特异性评估

15 份感染其他病原体的样本结果均为阴性, 无交叉反应｡30 mg/mL 游离血红蛋白､60 mg/mL 甘油三酯､0.6 mg/mL 胆红素､40 mg/mL 总G 型免 疫蛋白(IgG)及800 IU/mL 的类风湿因子的Ct 值 与对照组比较,差异无统计学意义( P>0.05 )｡见 图2A｡300 U/mL IFNα,4.5 μg/mL 拉米夫定,75 ng/mL 阿德福韦酯,15 μg/mL 替比夫定,50 ng/mL 恩替卡韦的Ct 值与对照组比较,差异无统计学意义 (P>0.05) )｡见图2B

2.3 HBV 核酸定量检测方法与对照试剂盒定性 分析的一致性比较

571 例样本中有6 例血清样本在使用本研究 建立的HBV 核酸定量检测方法与对照试剂盒时 检测结果不一致,本法检测结果判定为阳性,对照 试剂盒检测结果为阴性,采用复核试剂盒进行检 测,结果6 例样本均为阳性,与本文建立的方法检 测结果一致｡见表2｡

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表2 检测结果不一致样本的复核检测 Table 2 Retesting of samples with inconsistent results

60 例血浆样本中1 例检测结果在使用本研究 建立的HBV 核酸定量检测方法时为阴性,对照试 剂盒检测为阳性,结果不一致(表2⁃样本编号: X245),经复核为阴性,与本文建立的方法检测结 果一致｡

2.4 HBV 核酸定量检测方法与对照试剂盒定量 分析的一致性比较

血浆样本的检测差异均值为0.021 2｡见图 3A｡血清样本的检测差异均值为-0.011 3｡见图 3B｡针对血清和血浆样本,对照试剂盒与本文建 立的HBV 定量检测方法(考核试剂)的一致性限 的范围分别为(-0.312 8~0.355 2)和(-0.337 3~ 0.314 6),在临床认可标准范围内(-0.4~0.4);回归 分析显示,两者的线性度无明显偏差;但两种样本 的检测结果有统计学意义( P 均 <0.05)。

3 讨论

HBV DNA 载量通常被认为是衡量病毒复制 情况的“金标准”,与临床上乙肝的疾病活动度和 传染性密切相关 [8⁃10]｡欧洲肝病研究学会指南指 出HBV DNA 载量应尽可能控制在10~15 IU/mL, 并建议其最低检测限为30 IU/mL [11]｡目前,我 国的HBV DNA 检测多为基于煮沸法进行PCR 检测,耗时较长,灵敏度低,检测限普遍为500~ 1 000 IU/mL,因此临床普遍采用进口的高敏检测 试剂盒,虽然重复性好但价格昂贵｡本文建立了 一种基于Taqman 探针的定量PCR 检测方法,具有 以下优势:一､检测通量大,仅需2 h 可同时检测94 份标本;二､灵敏度高,重复性好,能有效区分不同 亚型和不同阳性程度的HBV 样本;三､全程闭管, 可有效避免污染;四､特异性高,与干扰物无交叉 反应｡且采用双荧光通道,检测结果直观,便于临 床推广｡

为进一步评价其临床性能,本研究还与目前市 场占有率较高的常规HBV DNA 检测试剂盒进行了 比较,结果发现:一､该方法灵敏度高,检测限低至 5 IU/mL,对HBVA⁃H 型强阳性､弱阳性和临界阳性 样本的检出率均为100%;二､特异性高,可能存在交 叉反应的15种病原体对检测结果均无影响;三､该方 法与对照试剂的一致性分析比较发现存在个别样本 检测结果不一致,后经过复核试剂确认和本法结果 一致｡其中,结果不一致的6例血清样本均为低浓度 样本,因为不同检测方法存在检测灵敏度的差异,可 能是导致对照试剂出现假阴性结果的原因;另有1例 血浆样本,考核试剂检测为阴性,而对照试剂则为阳 性,经复核结果与考核试剂一致,表明本文建立方法 准确性高,具有较好的临床应用价值｡

综上,本研究开发的HBV 核酸定量检测方法 具有较高的灵敏度和特异性,能够有效区分不同的 病毒亚型,性能符合临床要求,有望为乙肝的临床 诊断提供一种新的实验室检测方法和参考依据｡

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平均明显改善｡推测其原因可能是由于化疗可减轻 肿瘤导致的免疫抑制,使免疫失调重新趋于平衡,增 强对化疗的耐受能力,而TNF⁃ α ､IL⁃6 水平低表达､ IL⁃2 水平高表达可刺激T 淋巴细胞的增殖与分泌, 从而间接有利于患者预后改善｡表明抑制TNF⁃α､ IL⁃6 表达､上调IL⁃2 分泌可促进肿瘤细胞凋亡或坏 死,可能成为有效控制乳腺癌发生､发展的有效途径 之一｡进一步研究发现,预后良好组TNF⁃ α ､IL⁃6 水 平明显低于预后不良组,IL⁃2 高于预后不良组,说明 α ､IL⁃6､IL⁃2 可作为乳腺癌预后评估的指标｡ ROC 曲线结果显示,TNF⁃ α ､IL⁃6､IL⁃2联合预测晚期 乳腺癌预后的AUC 最高,说明多项指标联合检测可 有效减少筛检的误诊､漏诊率｡Singh 等 [16]报道亦发 现,阻断TNF⁃α､IL⁃6 信号通路､重组人IL⁃2 可抑制 癌细胞进展与转移,侧面反映了上述因子对晚期乳 腺癌的预后具有一定预测价值,与本研究报道相符｡

综上所述,TNF⁃α､IL⁃6､IL⁃2 在晚期乳腺癌患 者中呈异常表达,可作为评估化疗治疗疗效及预 测患者预后的有效辅助指标｡

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